技术干货 | 小鼠脾脏T细胞CFSE增殖实验详细操作指南

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T细胞是获得性免疫系统中的关键细胞，主要通过识别和杀伤病毒感染细胞、肿瘤细胞等，维持体内的免疫防御功能。它们分为辅助性T细胞和细胞毒性T细胞，分别负责激活其他免疫细胞和直接消灭病变细胞。

T细胞的研究价值在于其在疫苗研发、免疫治疗、癌症免疫疗法等领域的重要应用。通过深入研究T细胞的功能机制，科学家能够开发出更精准的治疗方法，提升免疫系统对疾病的抵抗能力。

小鼠脾脏T细胞CFSE增殖实验

制备脾脏单细胞悬液

1. 断颈或使用二氧化碳处死小鼠，使用75%酒精消毒后取出脾脏，PBS洗2遍，放置于70 μm无菌细胞滤网上。

2. 将脾脏所在的细胞滤网放入50 mL离心管，加入2 mL PBS，用注射器活塞轻轻研磨脾脏，使用EasyIso缓冲液反复冲洗细胞至离心管中。

3. 以400 × g离心5分钟，弃去上清液。

4. （可选）红细胞裂解：加入2 mL 1× ACK缓冲液，室温孵育1分钟。

5. （可选）加入5倍体积的PBS中和裂解液，400 × g离心5分钟，弃去上清液。

Note: 采用英诺思EasyIso™系列分离试剂盒，可以不用裂红。

6. 进行细胞计数。

增殖荧光染料标记细胞

7. 用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2x10^7/mL。

8. 使用1× PBS将增殖荧光染料（如CFSE，eFluo450等）稀释至10 μM（2×浓度）。

Note: 提前稀释染料能够使得标记更加均匀。

9. 将等体积10 μM CFSE加入细胞悬液中，终浓度为5 μM，迅速混匀并在37°C细胞培养箱中避光孵育10分钟。

10. 加入5倍体积的完全培养基（包含10% FBS），轻轻漩涡混匀，在4°C孵育5分钟终止反应，400 × g离心5分钟，弃去上清液。

11. 使用EasyIso™细胞分选缓冲液洗涤2次，重复步骤10。

细胞分选与激活

12. 按照细胞分选试剂盒说明书对细胞进行分选。

Note: 英诺思生物提供多种T细胞分选试剂盒。

13. 用T细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1 × 10^6/mL，每孔100 μL，最终每孔细胞数为1 × 10^5/孔。

14. 每孔补充100 μL T细胞激活培养基（T细胞激活培养基包含终浓度为100 U/mL human IL2，和25 μL/mL ActBeads T细胞激活磁珠）。

15. T细胞激活后24小时，镜下观察可以发现T细胞变大或者变长，代表T细胞得到很好的激活。可以采用CD25、CD69、CD71等标志物检测T细胞活化的情况。

16. T细胞激活后48-72小时，可以取部分细胞（如轻轻吹匀细胞，吸取50 μL），采用流式抗体和死活染料对细胞进行染色，最后进行流式分析，观察T细胞增殖峰的变化。

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